Hej!
Resultatet av gårdagens PCR och gelelektrofores blev rätt så bra. Banden på själva markören blev inte jätteskarpa, men vid avläsning av PCR-provet (nr 2 i bilden) syntes ganska tydligt att dess band låg ungefär runt 550bp. Det har dock smearat lite och egentligen så ligger den skarpaste delen av bandet lite innan.
 |
| 1. Markör IX 2. PCR - Eget prov 3. Neg. kontroll 4. Pos. kontroll 5. Plasmidprov |
Vi fick några band även nedanför själva plasmiden (nr 5). Dessa skulle kunna bestå av RNA, då RNA under alla processer det gått igenom slagits sönder till mindre bitar av olika storlek. Sådana band kan även innehålla plasmider som har fått en nick i supercoilen och genom detta fått en öppen cirkulär form som gör att de inte kan vandra lika långt.
Hur mycket man kan lita på resultatet är beroende av hur den positiva och negativa kontrollen ser ut. Den negativa kontrollen blev i vår gel ett långt smear. Detta kan bero på primerarna. Den har dock vandrat lika långt som det egna PCR-provet bredvid. Frågan är om detta inte beror på att vi vid pipetteringen råkat få i något av det egna provet i brunnen för den negativa kontrollen, även fast detta inte syntes vid pipetteringen. Den positiva kontrollen markerar tydligt LL37-genen, vilket den ska. Jag skulle tolka det som att vi kan lita på resultatet.
Hörs senare!
Hej Annika!
SvaraRaderaEr resultat ser bra ut !! Även om ni har fått en smear i negativ kontrollen kan man utesluta att det inte är en carry over kontamination (det skulle visas ett band istället för smear). Jag håller också med om att det kan beror på primrarna. Primrarna kan ha bundit till nått annat och amplifierats under PCR.
Dieu Linh
Hej Annika!
SvaraRaderajag ser att resultatet är bra, men som du peker att smear vid negativa kontrollen kan vara pga primrarna har bundit ospecifikt, men PCR produkten och positiva konrollen stämmer överens vilket förstärker beviset LL37 sekvensen och oklyvd plasmiden har inte fått något kontaminering, bra jobbat.
Jiyan
Hej Annika!
SvaraRaderaGrattis, ni har fått ett bra resultat! Jag håller med Dieu Linh att en Carryoverkontamination skulle ha sett annorlunda ut. Ni kan se tydliga Carryoverkontaminationer i några andra bloggar.
Jag kan inte se de band som du tror kan vara RNA. Både RNA och kromosomalt DNA bryts ner slumpmässigt. RNA bryts ner enzymatiskt av RNas som bryter fosfodiesterbindningar mellan nukleotider. I genomiskt DNA bryts också fosfodiesterbindningar, men inte enzymatiskt utan rent mekaniskt. Eftersom det sker slumpmässigt blir det många olika storlekar och det är osannolikt att det blir så många med samma storlek att man skulle se det som ett band på gelen. I stället bildas vad man kallar en "smear". Hur det ser ut kan du se på en bild i föreläsningskompendiet för Analys av nukleinsyror.
Märit
Märit