Hej!
Ja, idag har jag alltså renat en rekombinant plasmid. Det
bakteriesuspensionen blivit renad från är protein, kolhydrater, lipider, salter
m.m. och det som blir kvar är själva plasmiderna.
Vi gjorde en absorbansmätning där kvoten mellan absorbansen vid 280nm och
vid 260nm blev 1,808, vilket visar att proteinet har renats bort. Det säger
däremot inget om huruvida det finns RNA eller kromosomalt DNA kvar i lösningen.
Resultatet av absorbans och efterföljande beräkningar visade på en
plasmidkoncentration på 0,235 μg/μL. Detta resultat är beroende
av mängden bakterier vi fick med i den ursprungliga buljongpipetteringen.
Ni lärare får gärna ta upp lite om vad som renas bort vid varje steg i reningen, det känns inte riktigt glasklart.
Hörs!
Hej Annica,
SvaraRaderabra att du skriver att du inte kan veta om du har kromosomalt DNA och RNA kvar. När jag läste vad bakteriesuspensionen skulle renas från nämnde du inte dessa. Rent kemiskt liknar de ju plasmid-DNA, så man måste hitta någon egenskap som skiljer dem från plasmiden för att kunna få en bra rening. Vi använde två metoder som jag gick igenom vid labföreläsningen. Titta på de bilderna och jämför med protokollet, så tror jag att du kan se vad som renades bort vid olika steg.
Märit
Man renar den rekombinanta plasmiden från celldebris, proteiner samt kromosomalt DNA, RNas kommer bryta ner RNA delvis vid tillsats av P2 buffert, som lyserar membranet och denaturerar DNA:t, vid naturaliseringen så klumpar sig DNA och proteiner aggregerar ofta till varandra, sedan centrifugeras dessa till en pellet och det du vill ha kvar är plasmiderna. Renhet testades då med spektrofotometrin och era värden ser jättebra ut! Du borde ta upp lite mer om reningen och tex. vad en kolonn är. Du lär dig mer om vad som händer om du förstår vad du gör och använder!
SvaraRaderaMvh Anders